《自然·医学》：免疫治疗毒性大的患者，治疗前T细胞有这些特征

原标题：《自然·医学》：免疫治疗毒性大的患者，治疗前T细胞有这些特征

近年来，免疫治疗凭借其远超传统疗法的效果，以及较少的副作用，彻底改变了癌症临床治疗的现状。但是副作用少并不代表没有，大约有10%-60%的黑色素瘤患者，在接受免疫治疗后会出现严重的免疫相关副作用（irAEs）[1]。

这些副作用会对患者的许多器官组织造成破环性影响，导致多种疾病甚至死亡，然而 引起irAEs的生物学驱动因素仍然不明确，并且在临床实践中也缺乏判断患者出现irAEs风险的标准方法[2]。

近日，由 华盛顿大学的Aadel A. Chaudhuri和斯坦福大学的Aaron M. Newman领衔的研究团队，在《自然·医学》发表重要研究成果[3]。

他们利用多种测序和流式细胞技术 （主要是单细胞测序、bulk测序，以及TCR测序），分析了96个免疫治疗前和治疗早期的黑色素瘤患者血液样本和3个患者队列 （分别包括27、26、28例患者），发现 在治疗前血液中活性CD4记忆T细胞丰度，以及TCR的异质性与患者出现irAE有关，并且这一关联与发生副作用的器官无关。

▲ 论文首页截图

免疫治疗的原理就是通过给免疫系统“松绑”——利用免疫检查点抑制剂阻断免疫抑制通路，来激活免疫细胞（主要是T细胞），从而使其攻击癌细胞产生抗癌效果。

但是这样的方式同样增加了正常组织被免疫系统攻击的风险，会造成免疫相关的不良反应，而由于受到免疫系统攻击的器官组织不同，免疫治疗产生的不良反应也并不一致。通常受影响的组织包括肺、肝、心脏、皮肤、垂体以及胃肠道[4]。

之前有一些研究探究了与irAE有关的生物标志物，但是 要么只专注于对免疫治疗早期出现irAE进行预测，或者是预测单个器官的irAE，要么就是没有将出现低分级irAE的患者纳入分析[5-7]。

这些结果都 没有证明是否存在一个通用的治疗前就能检测，且与治疗后irAE有关的免疫状态。

为了解决这个问题，Aadel和Aaron团队招募了78例转移性黑色素瘤患者，在采用排除标准后，最终纳入分析的为71例患者。其中33例患者接受PD-1抑制剂治疗，38例患者接受PD-1和CTLA-4抑制剂联合治疗。

他们随后将这71例患者分为3个不重叠的队列：1个应用单细胞技术的队列，两个应用bulk测序技术的队列 （其中一个为模型训练队列另一个为验证队列）。

▲ 研究设计

研究人员分别分析了每个亚群与出现严重irAE之间的关联，发现 在治疗前只有CD4效应记忆T细胞（Tem）的丰度与irAE有关。

▲ 在患者治疗前血液中，治疗后出现irAE的患者CD4Tem丰度要显著高于不出现irAE的患者

为了进一步证实这个结论，他们对18例患者中的13例患者的治疗前血液样本进行了单细胞TCR和BCR测序，然后基于一些经典的特征基因的表达量，将24807个细胞分为了32种具有不同转录组状态 （特征基因组合表达水平的差异）的细胞亚型。

接着研究人员计算了32种细胞亚型的丰度与出现irAEs的关系，发现 CD4T细胞状态5（state 5）与出现严重的irAEs有关。而CD4T-state5在特征基因表达模式上与CD4Tem一致，并且在流式细胞分析中，CD4T-state5的丰度与CD4Tem是有关联的。

后续分析中他们发现 CD4T-state3也与irAE有关，并且将其与CD4T-state5组合成一类后，这个组合与irAE的关系更强了。然后他们将CD4T-state5和state3的组合根据与激活状态有关的标志物分成了活性和休眠两个亚群，发现和休眠亚群相比，活性亚群与irAE的关系更强，表明活性CD4Tem更有可能导致严重的irAEs。

▲ CD4T-state5和CD4T-state3的组合与irAE的关联更强

基于这个结论，研究人员想知道黑色素瘤患者治疗前的血液中，活性CD4Tem的TCR异质性是否会与irAE的出现有关。结果表明 与未出现irAE的患者相比，在发生了严重irAE的患者中，其治疗前血液样本中活性CD4Tem的TCR异质性显著增加。

▲ 出现严重irAE的患者其治疗前血液中活性CD4T 5+3的TCR异质性显著增加

在利用之前的单细胞分析结果检验了bulk数据分析用到的计算软件的准确性后，研究人员发现 在患者治疗前血液样本中与出现irAE相关的因素仍然是活性CD4Tm的丰度以及TCR的异质性，并且这种关联与患者接受的免疫治疗方案无关。

于是研究人员利用二元逻辑回归框架，开发了一个能综合这两种因素的影响的模型。事实证明，这个模型对患者治疗后是否会出现irAEs的预测效果要优于任意一种因素的单独预测效果，并且他们在排除了例如免疫治疗方案、年龄、性别以及黑色素瘤分型等的影响之后，模型仍然有较好的预测效果。

▲ 综合了两种因素的模型对irAE的发生有更好的预测效果

其实除了关注患者在接受免疫治疗后会不会出现严重的irAEs，临床上也同时关心患者会在治疗后多长时间内出现严重的irAEs，因此研究人员基于模型的打分，将患者分为高风险和低风险两组。

他们发现 高风险组患者出现严重irAEs的中位时间是1.74个月，而在低风险组中大部分的患者都没有出现严重irAEs。这表明他们开发的模型还能够预测黑色素瘤患者在接受免疫治疗后多久会出现严重irAEs。

以往的研究发现，免疫治疗后产生致死性irAEs的黑色素瘤患者的受影响器官中，自体T细胞和抗病毒T细胞均出现了克隆扩张。因此研究人员猜测，产生严重irAEs的患者的血液中的T细胞应该也会出现TCR亚型的扩张。

为了验证这个猜想，研究人员利用immunoSEQ分析了15例转移性黑色素瘤患者的治疗前和治疗早期血液样本的TCR-β链。他们发现 与没有出现严重irAEs患者相比，出现严重irAEs的患者在治疗后血液中TCR亚型出现了显著扩张，并且扩张比例更大的患者会更快出现严重irAEs。

鉴于有研究提到了自身免疫和irAE的关系，研究人员综合了6项研究的数据，包括了587个患有系统性红斑狼疮（SLE）或者炎症性肠病（IBD）的患者以及191个健康人。

研究人员分析了这些人血液中15种白细胞丰度与自身免疫疾病的关系，发现 活性CD4Tm细胞有着最强的关联性，这表明患有自身免疫疾病的患者在接受免疫治疗时更有可能出现严重irAEs。

总的来讲，这项研究发现，黑色素瘤患者中存在着一种免疫治疗前免疫学状态，与治疗后是否出现严重irAEs有关；而且这个状态主要是由两种因素构成——活性CD4Tm的丰度以及TCR的异质性，并且这两个因素还能预测患者出现严重irAEs的时间。

另一方面，这项研究还证明患有自身免疫疾病的患者出现严重irAEs的风险更高。 这给如何降低接受免疫治疗的黑色素瘤患者的副作用，提供了可行的方案。

参考文献：

[1] Kumar V, Chaudhary N, Garg M, Floudas CS, Soni P, Chandra AB. Current Diagnosis and Management of Immune Related Adverse Events (irAEs) Induced by Immune Checkpoint Inhibitor Therapy [published correction appears in Front Pharmacol. 2017 May 31;8:311]. Front Pharmacol. 2017;8:49. Published 2017 Feb 8. doi:10.3389/fphar.2017.00049

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